Ген клондау - бұл жалғыз геннің көшірмелерін немесе клондарын жасау актісі. Генді анықтағаннан кейін клондарды биомедициналық және индустриалды зерттеулердің көптеген салаларында пайдалануға болады. Гендік инженерия - гендерді жаңа организмдерге клондау немесе белок өнімдерін өзгерту үшін ДНҚ тізбегін өзгерту процесі. Генетикалық инженерия келесі негізгі рәсімдерді орындау қабілетімізге байланысты.
01 полимеразды тізбекті реакция
02 Ферменттерді шектеу
Эндонуклеэттерді шектеу деп аталатын ферменттердің ашылуы протеин жасауда маңызды болды. Бұл ферменттер ДНҚ-ны нуклеотидтік жүйеге негізделген белгілі бір орындарда қысқартады. Әртүрлі бактериялардың түрлі штамдарынан оқшауланған жүздеген әртүрлі шектеу ферменттері ДНҚ-ны нақты бір жерде кесуге қабілетті. ДНК шектеу энзимімен кесіліп, әртүрлі мөлшердегі бірнеше кішкене фрагменттерді шығарады. Олар гель электрофорезі немесе хроматография көмегімен бөлінуі мүмкін.
03 Электрофорез
ДНҚ-ны жасуша мәдениетінен тазарту немесе оны шектеу ферменттері арқылы кесу ДНК-ны көре алмасақ, яғни, сіздің сығындыңызда ештеңе жоқ екендігін немесе қандай да бір мөлшердегі фрагменттерді оны кесіңіз. Мұны жасаудың бір жолы - гель электрофорезі. Гельдер әртүрлі мақсаттарда, ДНҚ-ны қарап шығудан бастап ДНҚ-ны және нокауттарды анықтауға арналған.
04 ДНҚ екі бөлігін қосыңыз
Генетикалық зерттеулерде екі немесе одан да көп ДНҚ-ны біріктіруге, рекомбинантты жолды жасауға немесе шектеу ферменттерімен кесілген дөңгелек сызықты жабуға жиі қажет. ДНК лигасы деп аталатын ферменттер нуклеотидтік тізбектер арасында ковалентті байланыс жасай алады. Ферменттер ДНК полимеразы I және полинуклеотид киназы осы процесте, сондай-ақ, кемшіліктерді толтыру немесе тиісінше 5 'ұшын фосфорилирлеу үшін маңызды.
05 Кішкентай өзін-өзі репликаторлық ДНҚ-ны таңдау
Бактериалды геномның құрамына кірмейтін, бірақ өзін-өзі репликациялауға қабілетті ДНҚ-ның кіші шеңбер дозалары плазмидтер деп аталады. Плазмидтер жиі микроорганизмдер арасында гендерді тасымалдау үшін векторлар ретінде қолданылады. Биотехнологияда, қызығушылық гені күшейтіліп, ген мен плазмидті шектеу ферменттері арқылы кесіп тастағаннан кейін олар рекомбинантты ДНҚ деп аталатын нәрсе генерациялайды. Вирустық (бактериофагтық) ДНҚ-ақ вектор ретінде пайдаланылуы мүмкін, ғарышты, бактерияға қарсы гендерді қамтитын рекомбинантты плазмидтер.
06 Векторды қабылдаушы ұяшыққа жылжыту әдісі
Плазмид сияқты вектордағы генетикалық материалды жаңа қабылдаушы жасушаларға беру процесі трансформация деп аталады. Бұл техника қабылдаушы клеткалардың қоршаған ортаны өзгертуге ұшырауын талап етеді, ол оларды «құзыретті» немесе уақытша векторға өткізетін етеді. Электроэнергетика - мұндай техника. Плазмидтің мөлшері неғұрлым көп болса, ол жасушалармен қаншалықты тиімдірек болады. Үлкен ДНҚ сегменттері трансдукция деп аталатын әдіспен бактериофаг, ретровирус немесе басқа вирустық векторлар немесе космидтер арқылы оңайырақ клонированы. Фаза немесе вирустық векторлар регенеративті медицинада жиі пайдаланылады, бірақ біздің хромосомаларымыздың кейбір бөліктерінде ДНҚ-ның енгізілуін тудыруы мүмкін, бұл асқынулар мен тіпті қатерлі ісікке әкеледі.
07 Трансгендік ағзаларды таңдау әдістері
Трансформация кезінде барлық клеткалар ДНҚ алмайды. Міндетті түрде анықтау әдісі бар. Жалпы алғанда, плазмидтер антибиотикке қарсы гендерге ие және трансгенді жасушалар осы гендердің экспрессиясына және антибиотикті қамтитын медиада өсіру қабілетіне қарай таңдалуы мүмкін. Таңдаудың альтернативті әдістері тиісінше х-галь / lacZ жүйесіндегі немесе реңге және флуоресценцияға негізделген іріктеуге мүмкіндік беретін жасыл флуоресценттік ақуыз сияқты басқа репортерлік ақуыздардың болуына байланысты.