Ферменттік кинетиканы өлшеу
Фондық ферменттер - бұл реакция үшін белсендіру энергиясы мөлшерін азайту кезінде катализатор ретінде әрекет ететін белоктар. Белсенділік энергиясы - реакцияларды қабылдау үшін қажетті «энергия» болып табылады, себебі көптеген реакциялар термодинамикалық мүмкін болса, өте жылдам (немесе мүлде пайда болмайды).
Ферменттер реагенттердің өнімді генерациялау үшін байланыстыратын және әрекет ететін белгілі бір аймақтағы (белсенді аймақ ретінде белгілі) нақты реакцияларды катализдейді. Субстраттарда тек бір ғана сайтта байланысы жоқ немесе ешқандай реакция жасалмайтын белсенді сайттар бар. Құлып және кілт секілді, әрбір фермент бір ерекше реакцияны (кейбір қоспағанда) катализдейді.
Белгілі бір белсенділік белокты оқшаулау әдістерінде тазарту пайызын көрсету үшін қолданылады. Ферменттерді сатып алғанда, сіз бұл таза ферменттің қанша бөлігін көрсететінін білу маңызды.
Фермент кинетикасын өлшеу кезінде (субстрат немесе беті бар фермент реакциясының жылдамдығы) белгілі бір белсенділік ферментті препараттағы ферментті препараттағы протеинге арналған мг-ға шаққанда ферменттердің (реакция катализаторларының) субстратының мөлшері ретінде анықталады.
Белгілі бір қызметтің мысалы:
- Оқшауланған ферменттің нақты белсенділігі тазартылғанға дейін 150 л / мин / мг протеинде және тазартудан кейін 800 л / мин / мг болатын кезде өлшенді.
Белгілі бір қызмет фермент тазалығының маңызды шарасы болып табылады. Таза ферменттердің әртүрлі фармдарының бірдей мәндері болуы керек, тіпті фермент ерітіндісін бірнеше рет разрядтауға болады, бірақ әртүрлі фермент белсенділігінің мәндері болады. Себебі, белгілі бір қызметті есептегенде, сандық (бірлік / мл) және бөлгіш (мг / мл) бірдей әсер етеді.
Белгілі бір қызмет белсенділіктен өте ерекшеленеді, бірақ белгілі бір қызметті есептеу әлі де белсенділік мәніне байланысты. Бұл белгілі бір қызмет құндылығы фермент бөлімінің анықтамасына тәуелді болады дегенді білдіреді.
Күтілетін белгілі бір белсенділік мәнінен төмен ферменттердің бумалары құрамында өзгертілген немесе қоспалармен араласқан фермент молекулалары болуы мүмкін.
Фермент белсенділігіне әсер ететін факторлар
Әр түрлі зертханаларда өлшенген кезде бір ферменттің әр түрлі өлшенген белсенділік мәндері болуы мүмкін (яғни, өлшенетін белсенділік бойынша нақты айырмашылықтар, әртүрлі модуляция анықтамаларын пайдаланудан туындаған айтарлықтай айырмашылықтар емес).
Талдау әдісі (ферменттердің тазалығын анықтау үшін тестілеу әдісі) есептелген белсенділік мәніне әсер етеді. Мысалы, ферменттер, әдетте, 20 градус Цельсийге қарағанда 37 градус температура арасында жиі белсенді болады, сондықтан егер талдау 21 градус Цельсийде жүргізілсе, мәндер 32 градус Цельсий температурасында жүргізілген талдаудан (әдетте, , талдау 20-37 градус Цельсий температурасы бойынша жүргізіледі).
Осылайша, фермент бөлігінің анықтамасы 1 бірлік (U) - стандартты шарттарда минутына 1 нмоль субстрат реакциясын катализдейтін ферменттер саны ретінде жақсы көрсетіледі.