Ақуыздың тазалығының дәрежесі ақуыздың мақсатты қолданылуына байланысты.
Кейбір қосымшаларда шикі сығынды жеткілікті. Дегенмен, азық-түлік және фармацевтика сияқты басқа мақсаттарда тазалықтың жоғары деңгейі қажет. Осы мақсатқа жету үшін бірнеше тазартқыш әдістер қолданылады.
Әрбір ақуызды тазарту сатысы әдетте өнімнің жоғалуына әкеледі. Демек, мінсіз ақуызды тазарту стратегиясы - тазалаудың ең жоғарғы деңгейі ең аз қадамдарға жеткенде. Қолданылатын қадамдарды іріктеу өлшемі, заряды, ерігіштігі және мақсатты ақуыздың басқа да қасиеттеріне байланысты болады. Бір цитосолалық ақуызды тазарту үшін келесі әдістер ең қолайлы. Цитоциклдік ақуыз кешендерін тазалау күрделі және әдетте әр түрлі әдістерді қолдануды талап етеді.
Протеинді тазартудың алғашқы қадамдары
Жасуша ішіндегі (клетканың ішіндегі) ақуыздарды тазартудағы алғашқы қадам - бұл шикі сірінді дайындау.
Сығындыда жасуша цитоплазмасынан барлық белоктардың күрделі қоспасы және кейбір қосымша макромолекулалар, кофакторлар және қоректік заттар болады. Шикі сығынды биотехнологиядағы кейбір қосымшаларда қолданылуы мүмкін, бірақ егер тазалық мәселе болса, кейіннен тазарту қадамдарын сақтау керек.
Шикі протеин сығындылары химиялық заттар мен ферменттер , Ультрадыбыспен немесе француз баспасөзі арқылы қол жеткізілетін жасушалық лизис жасайтын клеткалық қалдықтарды жою арқылы дайындалады. Қоқыс центрифугалау арқылы жойылады, ал супернатант қалпына келтіріледі. Жасушадан тыс протеиндердің шикі препараттарын центрифугалау арқылы клеткаларды оңай алып тастау арқылы алуға болады.
Кейбір биотехнология қосымшалары үшін термостерлейтін ферменттерге деген сұраныс бар: жоғары температураны конфигурациялаусыз және жоғары белсенділікті сақтай отырып, ферменттер. Оларды шығаратын ағзалар кейде экстремалды деп аталады. Ыстыққа төзімді ақуызды тазартудың қарапайым тәсілі - қоспаның басқа протеиндерін жылыту арқылы денатураттауға, содан кейін ерітіндіні салқындатуға (қажет болған жағдайда термостағы ферментті түзетуге немесе қайта қалпына келтіруге мүмкіндік береді) Денатизирленген ақуыздар содан кейін центрифугалау арқылы жойылуы мүмкін.
Аралық тазалау қадамдары
Өткен кезеңде шикі сығындыдан ақуызды тазартудың екінші қадамы жоғары осмотикалық күші бар ерітіндіде (яғни, тұзды ерітінділермен) болды. Шикі сығындыдағы нуклеин қышқылдары стрептомицин сульфаты немесе протамин сульфаты бар тұндыру агрегаттарымен жойылуы мүмкін.
Протеинді жауын-шашын әдетте аммоний сульфаты тұз ретінде жасалады.
Әртүрлі ақуыздар аммоний сульфатының әртүрлі концентрацияларында пайда болады. Жалпы, жоғары молекулалық массаның ақуыздары аммоний сульфатының төмен концентрациясында тұндырады. Тұз жауын-шашын әдетте жоғары тазартылған ақуызға әкелмейді, бірақ қоспаның құрамында қажетсіз протеиндерді жоюға және үлгіні шоғырландыруға көмектеседі. Содан кейін ерітіндідегі тұздар кеуекті целлюлозалық түтік арқылы диализ арқылы жойылады, сүзгілеу немесе гельді алып тастау хроматографиясы.
Қазіргі заманғы биотехникалық хаттамалар әдеттегі процедуралар үшін дайын шешімдерді ұсынатын коммерциялық қолжетімді жиынтықтардың көбін пайдаланады. Протеинді тазалау көбінесе сүзгілер мен гельді сүзгілеу колонналары арқылы жүргізіледі. Мұның бәрі нұсқауларды орындап, дұрыс шешімнің дұрыс көлемін қосып, жаңа сынақ түтікшесінде элютантты жинағанда (бағанның екінші жағы шыққан) белгілі бір уақытты күтіңіз.
- Хроматографиялық әдістерді стендтік бағандар немесе автоматтандырылған HPLC жабдығы арқылы қолдануға болады. HPLC арқылы бөлу кері фазалық, ион алмасу немесе мөлшерін шығару әдістерімен және диод массиві немесе лазер технологиясымен анықталған үлгілер арқылы жасалуы мүмкін. مور
Протеинді визуализациялау және тазартуды бағалау
- Фазалық хроматография (RPC) олардың салыстырмалы мономолекулярлық қасиеттеріне негізделген ақуыздарды бөледі. Бұл әдіс өте селективті, бірақ органикалық еріткіштерді қолдануды талап етеді. Кейбір белоктар еріткіштермен тұрақты түрде денатуратталады және RPC кезінде функционалдылықты жоғалтады. Сондықтан бұл әдіс барлық қосымшалар үшін ұсынылмайды, әсіресе мақсатты протеиннің белсенділігін сақтау үшін қажет болса.
- Ион алмасу хроматографиясы заряд негізінде ақуыздардың бөлінуін білдіреді. Колонналар анион алмасу немесе катиондарды алмастыру үшін дайындалуы мүмкін. Анионды айырбас бағандарда теріс зарядталған ақуыздарды тартатын оң зарядпен стационарлық фаза бар. Катионды айырбас бағандары оң зарядталған ақуыздарды тартатын кері, теріс зарядталған моншалар болып табылады. Мақсатты ақуыздың (лар) ерітіндісі бағанның рН мәнін өзгерту арқылы жүзеге асырылады, бұл әр белоктың зарядталған функционалдық топтарын өзгертуге немесе бейтараптандыруға әкеледі.
- Өлшемді хроматография ( гельді фильтрлеу ) өлшемі үлкен белоктарды кішігірім бөліктерден бөледі, өйткені үлкен молекулалар хроматография бағанында кросс-байланыстырылған полимер арқылы жылдам өтеді. Үлкен белоктар полимердің тесіктеріне енбейді, ал аз ақуыздар жасайды және хроматография бағанынан өтіп кету үшін ұзағырақ уақыт алады, олардың кемірек жолы арқылы. Элюат элюцияға негізделген ақуыздарды бөлетін түтіктер сериясынан жиналады. Гельді фильтрлеу протеин үлгісін шоғырландырудың пайдалы құралы болып табылады, себебі мақсатты ақуыз бастапқыда бағанға қосылатын қарағанда аз элюция көлемінде жиналған. Мұндай фильтрация әдістері ақуыздың ірі өндірісінде олардың экономикалық тиімділігіне байланысты пайдаланылуы мүмкін.
- Аффинді хроматография - бұл ақырын тазарту процесін «тазарту» немесе аяқтау үшін өте пайдалы әдіс. Хроматография бағанындағы моншақтар мақсатты ақуызға тікелей байланысы бар лигандармен байланысады. Ақуыз бағаннан бос лигандтар бар ерітіндімен жуылады. Бұл әдіс басқа әдістермен салыстырғанда таза нәтиже мен ең жоғары нақты белсенділікті береді.
- SDS-PAGE - бұл өте үлкен теріс зарядты беретін белоктарға байланысатын SDS (натрий додецил сульфаты) қатысуымен орындалған полиакриламидті гель электрофорезі. Барлық протеиндердің заряды әбден тең болғандықтан, бұл әдіс олардың мөлшеріне қарай толығымен бөледі. SDS-PAGE көбінесе сериядағы әрбір қадамнан кейін ақуыздың тазалығын тексеру үшін қолданылады. Қажетсіз белоктар біртіндеп қоспасынан алынып тасталса, SDS-PAGE гелінде бейнеленген топтар саны, қажетті белокты білдіретін тек бір жолақ болғанша азаяды.
- Иммуноблотинг - бұл аффинді хроматографиямен бірге қолданылатын ақуызды визуализация әдісі. Белгілі бір протеинге арналған антиденелер лиганттар ретінде аффинді хроматография бағанында қолданылады. Мақсатты белоктар бағанда сақталады, содан кейін бағанды тұз ерітіндісімен немесе басқа агенттермен шаю арқылы жойылады. Радиоактивті немесе бояғыш затқа байланысты антиденелер мақсатты ақуызды анықтауға көмектеседі, ол қоспаның қалған бөлігінен бөлінеді.
Көздер:
Зубай Г. 1988. Биохимия, 2-ші басылым. Macmillan Publishing Co., Нью-Йорк, NY, АҚШ.
Amersham Pharmacia биотехникасы. 1999. Ақуызды тазалау жөніндегі анықтамалық, AB басылымы. Amersham Pharmacia Biotech Inc. Нью-Джерси, АҚШ. http://www.biochem.uiowa.edu/donelson/Database%20items/protein_purification_handbook.pdf.