ДНҚ реттелуімен және күшейтетін гендермен қандай PCR істеу керек
Полимеразды тізбекті реакция ( ПТР ) геннің көптеген көшірмелерін жасау үшін молекулалық-генетикалық әдіс болып табылады және ген тізбегінің процесінің бір бөлігі болып табылады.
Полимераз тізбегі реакциясы қалай жұмыс істейді?
Гендік көшірмелер ДНҚ үлгісі арқылы жасалады және технологияда үлгідегі табылған геннің бір данасынан бірнеше көшірме жасау үшін жеткілікті жақсы. Миллиондаған көшірмелерді жасау үшін геннің ПТР күшейтуі, ДНҚ бөлігінің өлшемі мен зарядталуына (+ немесе -) негізделген көрнекі әдістерді қолдана отырып ген тізбесін анықтауға және сәйкестендіруге мүмкіндік береді.
ДНҚ-ның кіші сегменттері ДНК полимеразы деп аталатын ферменттер арқылы жасалады, олар «деконтам» деп аталатын ДНҚ бөлігіне тегін деоксинуклеотидтерді (dNTPs) қосады. Полимераз үшін бастапқы нүкте ретінде «праймерлер» деп аталатын ДНҚ-ның кішірек бөліктері де қолданылады. Примерлер - ДНҚ-ның (олигомерлердің) кішкентай адам жасаған бөліктері, әдетте 15-тен 30-ға дейінгі нуклеотидтер. Олар геннің ең соңында күшейтілетін қысқа ДНҚ тізбегін білу немесе болжау арқылы жасалады. ПТР кезінде дәйектелген ДНҚ жылытылады және қос тізбектер бөлінеді. Салқындаған кезде праймерлер үлгіні (жыртқыш деп аталады) байланыстырады және полимераздың бастауы үшін орын жасайды.
ПТР техникасы
Полимеразды тізбекті реакция (ПТР) термофилді және термофилді полимераз ферменттерін (жоғары температурада жылытудан кейін құрылымдық тұтастық пен функционалдылықты сақтайтын ферменттер) ашуы арқылы мүмкін болды.
ПТР әдісіне қатысты қадамдар төмендегідей:
- ДНҚ үлгісінің, полимераз ферменттерінің, праймерлердің және дНТП-ның оңтайландырылған концентрациясы бар қоспалар жасалады. Ферментті мөлшерлеместен қоспаны қыздыру қабілеті 94 градус Цельсий диапазонында ДНК үлгісінің қос спиральын денатурациялауға мүмкіндік береді.
- Денатурациядан кейін үлгілі 54 градусқа жуық қалыпты диапазонға дейін салқындатылады, бұл праймерлердің бір жақты ДНҚ үлгілеріне жайландырылуына (байланыстыруға) көмектеседі.
- Циклдың үшінші сатысында сынама ұзарту үшін Taq DNA Polymerase үшін тамаша температура 72 градусқа дейін қызады. Ұзарту барысында ДНҚ полимеразы әр бір праймердің 3 'ұштарына қосымша дНПП қосатын және қызығушылық генінің аймағында екіқабатты ДНҚ секциясын генерациялау үшін үлгі ретінде ДНҚ-ның бастапқы бір жолын пайдаланады.
- Дәлдікке сәйкес келмейтін ДНК тізбегіне жалтыраған праймерлер 72 градусқа күйіп қалмайды, осылайша қызығушылық геніне ұзартады.
Денатирлеу, жану және ұзарту процесі бірнеше рет (30-40 рет) қайталанады, осылайша экспоненталық қоспада керекті геннің көшірмелерінің санын көбейтеді. Қолмен орындалатын болса, бұл процесс өте қиын болғанымен, үлгілерді молекулярлық зертханаларда әдеттегідей бағдарламаланатын термоксидтерде дайындауға және инкубациялауға болады және толық ПТР реакциясын 3-4 сағатта орындауға болады.
Әрбір теңдестіру қадам алдыңғы циклдің ұзарту үдерісін тоқтатады, осылайша ДНҚ жаңа жолын қысқартады және оны қажетті геннің мөлшеріне дейін сақтайды.
Ұзарту циклінің ұзақтығы қызығушылық генінің мөлшеріне байланысты ұзағырақ немесе қысқа болуы мүмкін, бірақ сайып келгенде, ПТР қайталама циклдары арқылы үлгілердің басым бөлігі тек қызығушылық генінің өлшемімен шектелетін болады, өйткені олар екі праймердің өнімдерінен алынатын болады.
Нәтижелерді жақсарту үшін манипуляциялауға болатын табысты ПТР үшін бірнеше түрлі факторлар бар . PCR өнімінің болуын тексеру үшін ең көп қолданылатын әдіс - агарозды гель электрофорезі . ДНҚ бөліктерін мөлшері мен заряды негізінде бөлуге арналған. Фрагменттер бояғыштар немесе радиоизотоптар арқылы визуалданады.
Эволюция
ПТР табылғаннан бері, түпнұсқа Так айырмашылығы бар ДНК полимеразы табылды. Олардың кейбіреулері жақсы «түзету» қабілетіне ие немесе жоғары температураларда тұрақты, сондықтан ПТР ерекшелігін жақсартады және қате dNTP енгізуден қателерді азайтады.
ПТР-дың кейбір нұсқалары арнайы қосымшаларға арналған және қазіргі уақытта молекулалық-генетикалық зертханаларда үнемі пайдаланылады. Олардың кейбіреулері нақты уақыттық ПТР және кері-транскриптаз ПТР. ПТР табылуы ДНҚ-ның дәйектілігі, ДНҚ саусақ іздері және басқа да молекулалық техникалардың дамуына әкелді.