Polymerase Chain Reaction (PCR) реакциясының кез-келген компоненттеріне түзетулер өнімнің өнімділігін немесе сапасын жоғарылату немесе азайту немесе реакцияның спецификасы мен сезімталдығын арттыру арқылы нәтиженің сапасын өзгертуі мүмкін. Соңғы нәтижеге әсер ететін параметрлер физикалық (яғни температура, цикл уақыттары) немесе химиялық (мысалы, шоғырлану үлгісі, қолданылатын ферменттер түрі) болуы мүмкін. Төменде ПТР табыстылығына ықпал ететін бірнеше негізгі факторлар бар.
01 Таза зертханалық жағдай
ПТР бір ДНҚ молекуласын табуға қабілетті болғандықтан, зертханадағы таза жағдайларды сақтау маңызды. Әрдайым жаңа қолғап киіңіз, стерильді шыны ыдыстарды, түтікшелерді, тамшуыр ұштарын және стерильді ерітінділерді қолданыңыз және жұмысты бастамас бұрын жұмыс орнын тазалаңыз.
ДНҚсыз және ферментсіз үлгідегі бақылау реакцияларын әрдайым дұрыс үлгінің күшейтуіне байланысты болуын қамтамасыз ету үшін енгізіңіз.
Көптеген адамдар ақаулықты жоюды жеңілдету үшін ортақ пайдаланылмайтын шешімдер жиынтығына ие екендігіне көз жеткізеді, алайда олар тек ПТР үшін бөлінеді. DNase және RNase-free PCR түтіктері, аэрозольге төзімді пипетка кеңестері және ультракүлгін сәулесімен түтін сорғышта жұмыс істейтін ақ проблемаларды азайту жолдары.
02 Химиялық компоненттер
- 18-ден 24-ге дейін базалар
- Екінші құрылым жоқ (мысалы, шнурлы ілмектер)
- G / C және A / T жұптарын теңдестірілген бөлу
- 3-фут аяғында бір-бірін толықтыра алмайды
- Температураның төменгі температурасы (Tm) шамамен 5-10 градус Цельсий бар, әдетте 55-65 градус Цельций
Екі праймерге арналған Tm ең жақсы нәтижелерге де ұқсас болуы керек.
03 Reaction Mix: Үлгі және Примерлер
Оңтайлы праймер концентрациялары 0,1-ден 0,6 мкмоль / л-ға дейін. Үлгі саны ДНҚ түріне байланысты өзгереді (адам, бактерия, плазмид).
Шаблонның өте аз мөлшерімен нəтижелерді жақсартудың басқа да стратегиялары бар, мысалы, цикл санының өсуі немесе «ыстық бастау». Әрқашан жаңа праймерлерді сынаудың оң әсерімен сынап көріңіз, олар сіздің нақты эксперимент шарттарында жұмыс істейтініне сенімді болу үшін.
04 Reaction Mix: Фермент белсенділігі
Реакциялық қоспадағы MgCl2 концентрациясы ПТР-ның нәтижесіне әсер етуі мүмкін және ол неғұрлым қатаң реакцияларда маңызды рөл атқаруы мүмкін. Магний катионды полимераз ферментін танитын нақты субстратты шығару үшін dNTPs бар еритін кешендерді құрайды.
Барлық төрт dNTP тең мөлшерде полимераздың қателігін азайтуға көмектеседі. Бетаин, BSA, жуғыш заттар, DMSO, глицерин және пирофосфатаза тәрізді кейбір қоспалар ферменттің ерекшелігіне немесе реакция тиімділігіне әсер етуі мүмкін.
05 Thermocycler түрі
Зертханалық жабдықты сатып алу кезінде кейбір термоциклотиктер дәл, қалаған температураны ұстап тұрғанда басқаларға қарағанда нақтырақ екендігін есте сақтаңыз.
Бұл арзанға түсетін бір сала сіз ұзақ уақыт бойы ақырын реакцияға тап болғанда немесе жанбайтын температураның тар диапазонын қажет ететін праймерлерді пайдаланғанда төленбейді.
Жіңішке қабырғалы реакция түтіктері сіз қолданып отырған термокситтердің дәл брендіне сәйкес келеді, сонымен қатар реакция температурасын оңтайландыруға көмектеседі.
06 Цикл параметрлері
Үлкен өнімділікті әрбір 20 цикл бойынша ұзарту уақытын ұлғайту арқылы аз мөлшерде ферментті көбірек үлгіні күшейту үшін өтеуге болады. Әдетте, 40 циклден аз, шоғырлануға дейін 10 шаблоннан кем молекулаларды күшейту үшін жеткілікті мөлшерде бромидті- агароздық гельдің этидиумын көру үшін жеткілікті.