ДНҚ-ны дәйектеу, сонымен қатар, бір базалық жұптың өлшемімен ерекшеленетін ДНҚ бөліктерін бөлуге арналған гель электрофорезін қолдану мүмкіндігімізге байланысты.
ДНҚ реттелуі
1970 жылдың аяғында ДНҚ молекулаларының ұзарғаны үшін ДНҚ-ның екі реті анықталды. Бұл Sanger (немесе dideoxy) әдісі және Maxam-Gilbert (химиялық бөліну) әдісі. Максам-Гилберт әдісі химиялық заттардың нуклеотидті бөлінуіне негізделеді және олигонуклеотидтерді (қысқа нуклеотидті полимерлерді, әдетте ұзындығы 50 базалық жұптан аз) біріктіру үшін жақсы қолданылады. Sanger әдісі жиі қолданылып келеді, себебі ол техникалық жағынан жеңілдетілген және ПТР пайда болуымен және техниканы автоматтандырудан бастап, кейбір гендерді қамтитын ДНҚ-ның ұзын тізбектеріне оңай қолданылады. Бұл әдіс ПТР ұзарту реакциялары кезінде дидеокинуклеотидтердің тізбекті тоқтатылуына негізделген.
Sanger әдісі
Sanger әдісінде талданатын ДНҚ талшығы үлгі ретінде пайдаланылады және ПТР реакциясында праймерлерді пайдалана отырып, қосымша жіптерді жасау үшін ДНК полимеразы қолданылады.
Төрт түрлі ПТР реакциясының қоспалары дайын, олардың әрқайсысында төрт нуклеотидтің біреуіне (ATP, CTP, GTP немесе TTP) бірдей дидеоксинуклеид трифосфат (ddNTP) аналогтарының белгілі бір пайызы бар. Жаңа ДНҚ тізбегін синтездеу осы аналогтардың біреуі енгізілгенге дейін жалғасады, сол кезде қаптама мерзімінен бұрын қысқартылады.
Әрбір ПТР реакциясы әр түрлі ұзындықтағы ДНК тізбектерінің қосындысы болады, олардың барлығы осы реакцияға арналған дидеоксиді болатын нуклеотидпен аяқталады. Гель электрофорезі кейін төрт реакцияның жақтарын төрт бөлек жолдарда бөліп, қандай нуклеотидпен аяқталатын ұзындықтарға негізделген түпнұсқа үлгісінің реттілігін анықтайды.
Автоматтандырылған Sanger реакциясында төрт түрлі түсті флуоресценттік тегтермен белгіленген праймерлер қолданылады. ПТР реакциялары әр түрлі дидеоксидті нуклеотидтердің қатысуымен жоғарыда сипатталғандай орындалады. Содан кейін, кейіннен төрт реакциялық қоспалар біріктіріліп, бір гельдік жолаққа қолданылады. Әрбір фрагменттің түсі лазер сәулесі арқылы анықталады және ақпарат әр түсті үшін шыңдарды көрсететін хроматограммалар жасайтын компьютер арқылы жиналады, оның үлгісі ДНҚ үлгісі анықталуы мүмкін.
Әдетте автоматтандырылған схема әдісі ұзындығы шамамен 700-800 базалық жұптарға дейінгі дәйектер үшін дәл анықталады. Дегенмен, үлкен гендердің толық тізбектерін және шын мәнінде, тұтас геномдарды, Primer Walking және Shotgun sequencing сияқты қадамдық әдістерді пайдалана отырып алуға болады.
Бастапқы серуендеуде Үлкен генның жұмыс жасайтын бөлігі Сэнгер әдісімен жүйеленген. Жаңа праймерлер тізбектің сенімді сегментінен жасалады және түпнұсқа реакциялар ауқымынан тыс геннің бөлігін ретімен жалғастыру үшін пайдаланылады.
Штурттың дәйектелуі қызығушылықтың ДНҚ сегментін кездейсоқ кесіп тастауды, әрбір фрагменттің дәйектелуін және сәйкес келетін реттіліктерге негізделген бөліктерді реттеуге әкеледі. Бұл әдіс жабысатын бөліктерді құрастыру үшін компьютерлік бағдарламаны қолдану арқылы жеңілдетілді.